Box-Behnken响应面法优化养阴清肺汤加味提取工艺-风险投资具有中介性对吗

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择要:偏向优选养阴清肺汤加味提取工艺。方式采用HPLC法同时测定毛蕊花糖苷、丹皮酚、绿原酸、甘草酸,以条理阐发法(AHP)计算权重系数,多指标归纳评分连系Box-Behnken设计-相应面法考查乙醇体积分数、提取时间、提取次数对养阴清肺汤加味提取工艺的影响,优选醇提工艺。成效最佳提取工艺为采用69%乙醇,提取68 min,提取1次。结论优选的提取工艺节减可行,身分提取效率高,为养阴清肺汤加味提取工艺供应参考。


养阴清肺汤乃《重楼玉钥》之名方,方中药用生地苦寒之性滋肾水、润肺燥、袪疫毒;玄参、麦冬甘寒滋阴、养阴清热以解毒;白芍、丹皮敛阴泄热,浙贝母清热化痰以润肺,少许薄荷宣肺利气,生甘草以清热解毒,和谐诸药。热甚者,另加金银花、连翘,增解毒成果;诸药合用,共奏养阴清肺、解毒利咽之效。

Box-Behnken设计-相应面法是采用多元回来方程拟合因素和效应值之间的函数干系,通过对其阐发来追求最佳工艺参数,是打点多变量问题的一种有用统计方式,普及应用于多因素优化试验[1-5]。条理阐发(analytic hierarchy process,AHP)法是一种打点多方针的复杂问题的定性与定量相连系的决议阐发方式,加强了总体评价成效的科学性及公道性[6]。本实验以毛蕊花糖苷、丹皮酚、绿原酸、甘草酸提取量及出膏率为归纳评价指标,运用Box-Behnken设计-相应面法优选养阴清肺汤加味(ModifiedYangyin Qingfei Decoction,MYQD)醇提工艺,为该课题的后续研究开辟奠基基础。


1仪器与试药


1.1仪器


Agilent 1290 InfinityII超高效液相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司,包孕二元高压梯度泵、真空脱气机、主动进样器、柱温箱、DAD检测器、OpenLABCDS色谱工作站;CP225D电子阐发天平,德国赛多利斯公司。


1.2试药


生地、麦冬、玄参、薄荷、浙贝母、丹皮、白芍、生甘草、金银花、连翘药材均购自辽宁中医药大学附属病院,经辽宁中医药大学中药阐发教研室英锡相传授判定分别为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根;百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus(Linn.f.)Ker-Gawl.的干燥块根;玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根;唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部门;百合科植物浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鱗茎;毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮;毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根;豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根茎;忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾;木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实,均相符《中国药典》2015年版相关项下要求。


斗劲品毛蕊花糖苷、丹皮酚、绿原酸、甘草酸,均购自四川省维克奇生物科技有限公司,质量分数均≥98%,批号分别是wkq18010503、wkq18042001、wkq18022809、wkq18011803;乙腈、磷酸、醋酸为色谱纯,Merck公司;水为超纯水。


2方式与效验


2.1毛蕊花糖苷、丹皮酚、绿原酸、甘草酸的定量测定

2.1.1色谱前提色谱柱为Agilentporoshell SB-C18柱(100 mm×4.6 mm,2.7μm)。毛蕊花糖苷:勾当相为乙腈-0.1%醋酸水溶液(16∶84);体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长334 nm;阐发时间25min;进样量10μL;理论塔板数按毛蕊花糖苷峰计算应不低于5 000。丹皮酚、绿原酸、甘草酸:勾当相为乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱法式:0~10 min,30%~32%乙腈;10~12 min,32%~45%乙腈;12~20 min,45%~46%乙腈;20~25 min,46%~70%乙腈;体积流量1.0 mL/min;柱温35℃;检测波长254 nm;阐发时间25 min;进样量10μL;理论塔板数按丹皮酚峰计算应不低于5 000,各身分色谱峰与相邻峰的星散度均大于3.0。色谱图见图1。


2.1.2比较品溶液制备细密称取毛蕊花糖苷、丹皮酚、绿原酸、甘草酸比较品适量,加甲醇分别制成含毛蕊花糖苷10μg/mL的比力品溶液,以及含有丹皮酚20μg/mL、绿原酸40μg/mL、甘草酸280μg/mL的夹杂计较品溶液。


2.1.3供试品溶液制备细密称取本品粉末0.07 g置具塞锥形瓶中,列入10 mL甲醇,密塞,称定质量,超声处理30 min,放冷,再称定质量,加甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。


2.1.4线性干系考查分别细密量取“2.1.2”项下斗劲品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μL,用甲醇分别定容于10 mL量瓶制备获得6个质量浓度的系列比力品溶液,按“2.1.1”项下色谱前提举办测定,以较量品的质量浓度为横坐标(X),峰面积值为纵坐标(Y)举办线性回来,回来方程、线性领域及相相干数分别为丹皮酚Y=13.618 X+0.076 5,r=0.999 6,线性范畴0.1~0.4μg;甘草酸Y=89.614 X-16.029,r=0.999 4,线性范畴1.4~5.6μg;绿原酸Y=15.838 X-3.135 5,r=0.999 5,线性领域0.2~0.8μg;毛蕊花糖苷Y=81.933 X+6.514 5,r=0.999 2,线性领域0.05~0.20μg。


2.1.5周详度试验邃密汲取统一夹杂角力品溶液10μL,按“2.1.1”项下方式一连进样6次,效验毛蕊花糖苷、丹皮酚、绿原酸、甘草酸日内周详度效验RSD分别为1.09%、0.97%、0.84%、0.90%。


细密罗致上述斗劲品溶液10μL,延续4 d举办进样阐发试验,白昼细密度效验RSD分别为1.24%、1.06%、1.18%、1.01%,评释仪器邃密度优良。


2.1.6不乱性试验按“2.1.3”项下方式制备供试品溶液1份,于室温安排0、3、6、12、24、48 h,按“2.1.1”项下色谱前提,以峰面积为指标进样阐发。成效毛蕊花糖苷、丹皮酚、绿原酸、甘草酸48 h内峰面积的RSD分别为0.94%、0.45%、0.57%、0.87%,评释供试品溶液在48 h内不乱。


2.1.7重复性试验取供试品溶液6份,按“2.1.3”项下方式制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱前提举行阐发。成效毛蕊花糖苷、丹皮酚、绿原酸、甘草酸的质量分数为3.50、7.08、603.66、74.75 mg/g,RSD分别为1.05%、2.02%、1.39%、1.23%,评释方式重复性优良。


2.2 AHP法确定权重


凭据复方中药味君臣佐使配伍纪律及各身分药理感化强弱,本实验将出膏率和指标性身分提取量作为权重指标予以量化,即将5项指标分成4个条理,并确定各指偏向优先顺序为毛蕊花糖苷>丹皮酚>甘草酸=绿原酸>出膏率,构建成比拟较的判断优先矩阵,付与各项指标间的相对评分,指标身分对照的优先矩阵见表1。凭据表1评分效验,AHP法计算获得毛蕊花糖苷、丹皮酚、甘草酸、绿原酸、出膏率5项指标权重系数分别为0.460 0、0.252 7、0.1165、0.116 5、0.0543,一致性比例因子(CR)=0.044 7<0.10,即指标优先对照判断矩阵具有自得的一致性,权重系数有用[7]。

2.3 Box-Behnken相应面法优化提取工艺


2.3.1相应口试验设计及效验按照归纳评价指标对醇提工艺的影响,确定归纳评分(Y)=毛蕊花糖苷×0.460 0/毛蕊花糖苷最大值+丹皮酚×0.252 7/丹皮酚最大值+甘草酸×0.1165/甘草酸最大值+绿原酸×0.1165/绿原酸最大值+出膏率×0.0543/出膏率最大值,以乙醇体积分数(X1)、提取时间(X2)、提取次数(X3)作为考查指标举办Box-Behnken相应面设计,因素及程度见表2。

采用Design-Expert软件设计试验方案,对乙醇体积分数、提取时间、提取次数举办研究,效验见表2。


2.3.2试验效果阐发哄骗方差阐发对各因素举办多元二次回来,获得的回来方程Y=0.25+0.076 X1-0.086 X2-0.16 X3-0.043 X1X2-0.07 X1X3+0.057 X2X3+0.024 X12+0.048 X22+0.15 X32。

相应面效验的方差阐发见表3,P<0.05为明明项、P<0.01为极显明项,可以看出提取工艺考查的3个因素中,提取次数(X3)为极较着项,提取时间(X2)为显着项,乙醇体积分数(X1)为不明明项,P=0.065 2;2次项中,X32(P=0.016 0)为显着项,评释考查因素与相应面值之间并非节略的线性关连;各交互项之间均不较着,评释各因素之间交互感化不显明。模子集体具有较好的显着性(P=0.019 7),且失拟合水平不较着(P=0.051 3),评释模子能较好的反映乙醇体积分数(X1)、提取时间(X2)、提取次数(X3)与毛蕊花糖苷、丹皮酚、甘草酸、绿原酸、出膏率的加权得分(Y)之间的变革相干,能够预测和阐发养阴清肺汤加味的醇提工艺。


根据所得模子绘制的乙醇体积分数、提取时间、提取次数的交互感化对养阴清肺汤加味的醇提工艺影响的3D相应面图和等高线图见图2,从图2中可以看出,考查的3个对象3者交互感化不显着。软件得出养阴清肺汤加味醇提工艺为乙醇体积分数68.83%、提取时间1.136 h、提取次数1.061次,连系现实生产所需,将最佳醇提工艺确定为69%乙醇,提取68 min,提取1次。

2.4验证试验


凭据最佳醇提工艺,举行3次平行验证试验,毛蕊花糖苷、丹皮酚、甘草酸、绿原酸的均匀提取率分别为18.03、88.34、60.04、2 409.29 mg/g,RSD分别为0.72%、1.03%、1.57%、2.48%,阐明优选的提取工艺公道可行。


3商议


养阴清肺汤原为梅涧为白喉所设,该方滋肾水、补肺阴、润肺燥、祛疫毒,被普及应用于临床治疗肺肾阴虚之证,加减化裁,劳绩颇丰[8-10]。方中生地黄、玄参为君药,研究评释毛蕊花糖苷为地黄的代表性身分,具有抗炎、抗氧化多种感化[11]。而丹皮及白芍中均含有丹皮酚,且具有抗菌消炎、调理免疫功能的感化[12-13];绿原酸是金银花的指标性身分,具有抗炎、制止免疫等多种感化[14-15];甘草酸为甘草中首要活性身分之一[16-17]。是以从有用成份充实提取的角度思量,凭据该制剂特点及临床疗效,连系该方的君、臣、佐、使配伍相干,分别以毛蕊花糖苷、丹皮酚、甘草酸、绿原酸含量作为考查指标。创建HPLC测定4种身分含量的方式,采用波长切换法,色谱图中显示丹皮酚、甘草酸、绿原酸的最大吸收波长分别为274、237、327 nm,因为丹皮酚、甘草酸、绿原酸均在254 nm处吸收峰峰形较佳,且星散度也合适要求,为使操作轻便易行,选择在254 nm处举办检测,而色谱图中未显示毛蕊花糖苷吸收峰,凭据《中国药典》2015年版选择乙腈-0.1%醋酸水溶液(16∶84)为活动相,波长为334 nm举办检测。出膏率对药效及制剂工艺均有肯定影响,故同样选为评价指标。


本实验选择AHP法为多指标举办赋权,该法介于主客观赋权之间,有学者认为,采用主观客观连系的赋权法确定权重[18-19],不只思量了主观意识对各项指目的器重水平,又思量了各项指标原始数据之间的彼此接洽及影响,加强了总体评价成效的科学性及公道性。由此确定了毛蕊花糖苷、丹皮酚、甘草酸、绿原酸、出膏率5项指标权重系数分别为0.4600、0.252 7、0.116 5、0.116 5、0.054 3。在处理实验数据时,采用归纳评分法对试验效果举办科学量化,避免了以单一指标做质量节制的局限性,与中药复方的多构成、多靶点感化特点相契合[20]。


相应面成效评释,提取次数对有用身分提取有着明明的影响,提取时间次之,而乙醇体积分数无显着影响,这大要与选择的乙醇体积分数区间相关,且考查的各因素之间交互感化不较着。本研究接纳Box-Behnken设计-相应面法,通过HPLC波长切换法举行检测,考查乙醇体积分数、提取时间、提取次数对养阴清肺汤加味中毛蕊花糖苷、丹皮酚、绿原酸、甘草酸含量及出膏率的影响,通过条理阐发法确定权重概括评分举办工艺优化。计算得出醇提工艺为乙醇体积分数68.83%、提取时间1.136 h、提取次数1.061次,连系现实生产所需,将最佳醇提工艺确定为69%乙醇,提取68 min,提取1次。经验证明验评释该工艺不乱可行,为养阴清肺汤加味临床应用及相关研究供应了科学的实验依据。


参考文献(略)


根基:吴振起,高畅,杨璐,于艳,齐兆东.基于条理阐发法连系Box-Behnken设计-相应面法优选养阴清肺汤加味提取工艺[J].中草药,2019,50(12):2862-2867.